Ергешов Абдулла Арсланович

Институт фундаментальной медицины и биологии, Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия

Салихова Талия Илшатовна 

Институт фундаментальной медицины и биологии, Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия

Мубаракова Лилия Ринатовна

ООО «Лаборатория «Р.Т.Х.», Казань, Россия

Абдуллин Тимур Илдарович

Институт фундаментальной медицины и биологии, Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия

Волосяной покров головы играет важную роль в эстетике тела человека. Преждевременное выпадение волос, обусловленное физиологическими и патологическими процессами, зачастую приводит к психоэмоциональному дискомфорту и может негативно сказаться на взаимодействии человека в социуме. В этой связи создание эффективных терапевтических средств, предотвращающих патологическое выпадение волос, — актуальная биомедицинская задача [1].

Волосы являются придатком кожи и образуются в циклично обновляющихся волосяных фолликулах [2]. В образовании фолликулов участвуют стволовые клетки эпидермиса и дермы, взаимодействующие между собой посредством уникального набора сигнальных молекул [3]. Мезенхимные клетки инициируют появление зародышевого утолщения (плакоды) в эпидермисе, претерпевающего нисходящий рост с формированием фолликула [4, 5]. Клеточный состав зрелого фолликула представлен дифференцированными кератиноцитами (верхняя растущая область), недифференцированными эпителиоцитами и клетками волосяного сосочка (нижняя область), регулирующими циклический рост и выпадение волоса, а также клетками наружной эпителиальной оболочки и меланоцитами [2, 3, 5].

Изменение жизненного цикла волосяного фолликула от анагена (фаза роста) к телогену (фаза покоя) через катаген (фаза регрессии) включает ремоделирование эпителиального и мезенхимного компонентов [1]. Исследование молекулярных сигналов, регулирующих переход между этими фазами, является важным подходом к поиску трихологических средств [6]. На рост волос у млекопитающих влияет множество стимулирующих и ингибирующих факторов, таких как гормоны, факторы роста (ФР), цитокины, нейропептиды, природные и синтетические лекарственные молекулы [7]. Среди них пептидные ФР являются одними из наиболее активных регуляторов функционирования клеток волосяного фолликула, имеющих значительный терапевтический потенциал [6–8].

Низкие стабильность и биодоступность известных препаратов ФР (главным образом рекомбинантных) наряду с высокой стоимостью технологий их получения ограничивают применение ФР в составе терапевтических средств [7, 9]. В связи с этим в медицине и трихологии весьма востребованы низкомолекулярные пептидные аналоги, имитирующие действие природных ФР, но при этом преодолевающие недостатки рекомбинантных биопрепаратов. Подобные биомиметические пептиды могут обладать сигнальной и транспортной активностью, а также выступать антагонистами природных ингибиторов роста волос [9].

В качестве активного компонента косметических средств предложен ряд олигопептидов, стимулирующих регенерацию тканей кожи и рост волос. Трипептиды AHK и GHK в комплексе с ионами меди усиливают пролиферацию клеток волосяного сосочка и экспрессию VEGF в фибробластах при образовании фолликула [10, 11]. Октапептид тимозин β4 стимулирует раннюю дифференцировку стволовых клеток и экспрессию VEGF в эндотелиальных клетках [12]. Декапептид P3 замедляет переход фолликула в фазу катагена, продлевая активный рост, путем ингибирования модулятора циклического перехода фолликула FGF-5 [13]. Sh-полипептид 9, имитируя действие VEGF, способствует эффективному тубулогенезу сосудов [14]. Пептид AC2 ингибирует расщепление комплекса mTORC1 и подавляет аутофагию и апоптоз в клетках волосяного сосочка под действием дигидротестостерона [15]. Пептид DPS-1 способствует пролиферации клеток волосяного сосочка посредством активации сигнального пути WNT/β-catenin [16].

Одним из ведущих производителей пептидных аналогов ФР нового поколения является компания Caregen (Южная Корея, www.caregen.com). С использованием пептидной композиции Caregen разработан новый эффективный продукт — многокомпонентная сыворотка-активатор роста волос Hair FOOD (https://hairfood.ru). В работе проведено исследование эффектов сыворотки Hair FOOD при накожной аппликации в сравнении с эталонным препаратом миноксидилом на мышиной модели регенерации волос, включающее анализ трихологических и гистологических параметров, а также мониторинг микроциркуляции кожи при действии препаратов.

Материалы и методы

Материалы

Сыворотка-активатор роста волос Hair FOOD (произведено по заказу и под контролем ООО «Лаборатория «Р.Т.Х.», Россия), Генеролон^® (миноксидил 2%) (Белупо, Хорватия), золетил 100 (Вибрак, Франция), ксиланит (ксилазал) (Нитафарм, Россия), гистологические красители и расходные материалы (ООО «Биовитрум», Россия).

Животные

Мыши линии C57BL/6 (самки, 7–8 недель, 36 ± 3 г) приобретены в Научно-производственном комплексе «БиоТех» (Россия). Уход за животными проводился в соответствии с европейскими правилами защиты экспериментальных животных (Директива 2010/63/UE) и действующими российскими правилами (№ 742 от 13.11.1984, Министерство образования и науки). Животных содержали при температуре 20 ± 3 °С и влажности 65 ± 10%. Исследование одобрено Локальным этическим комитетом Казанского федерального университета.

Модель регенерации волосяного фолликула

Животных анестезировали под общим внутримышечным наркозом золетил-ксилазал в дозе 30–10 мг/кг соответственно. На спине животных депилировали участок 1,5 × 3 см с использованием триммера для удаления волос и крема для депиляции. Через сутки после депиляции на кожу мышей наносили исследуемые препараты: миноксидил 2%, сыворотку Hair FOOD и контрольный раствор (30% водный раствор этанола). Препараты апплицировали путем мягкого втирания в кожу аликвоты ~0,5 мл один раз в сутки в течение 7 дней.

Трихоскопический анализ

Получали панорамные фотографии обработанного участка кожи с использованием цифровой фотокамеры (16 мегапикселей). Также регистрировали изображения репрезентативных областей в режиме макросъемки с помощью цифрового устройства DP-M17 USB. Оценку параметров волосяного покрова и отдельных волос проводили с использованием программного обеспечения ImageJ (https://imagej.nih.gov).

Лазерная доплеровская флоуметрия

Регистрировали величину микроциркуляции и оксигенации обработанной кожи животных методом лазерной доплеровской флоуметрии (ЛДФ) с использованием контактного модульного зондового анализатора moorVMS-LDF/moorVMS-OXY (Moor Instruments, Великобритания) и бесконтактной системы визуализации EasyLDI (Aïmago, Швейцария). Измерения проводили в динамике под общим наркозом.

Гистологический анализ

Животных выводили из эксперимента путем ингаляции диоксида углерода под анестезией. Экспланты обработанной кожи фиксировали в 4% растворе формальдегида в фосфатно-солевом буфере (рН 7,4), дегидратировали в серии растворов этанола (50, 70, 90, 96 и 100%), обрабатывали толуолом и заключали в парафиновые блоки. Получали тонкие поперечные срезы кожи (7 мкм) на микротоме HM 355S (Thermo Fisher Scientific) с последующим окрашиванием гематоксилином-эозином (HE). Микрофотографии срезов получали на микроскопе Axio Obzerver Z1 (Carl Zeiss) Количественный анализ изображений гистологических срезов проводили с помощью программного обеспечения ImageJ.

Статистический анализ

Количественные данные представляли в виде среднего значения ± стандартного отклонения. Достоверность различий между выборками оценивали с использованием t-критерия Стьюдента с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 5.

Результаты

Влияние препаратов на рост волос по данным визуального анализа

Исследование проводили на инбредных мышах C57BL/6 (самках) возрастом 7 ± 1 недель, при котором происходит переход волос в фазу телогена [17, 18]. На депилированную кожу животных в течение 7 дней апплицировали следующие препараты: сыворотка Hair FOOD, миноксидил (2%), а также в качестве негативного контроля — смешанный растворитель этанол–вода, используемый для приготовления сыворотки Hair FOOD.

Проводили анализ фотографических изображений обработанной кожи в динамике. В качестве параметров роста волос оценивали относительную интенсивность черного окраса (пигментации) кожи в депилированной области, связанную с появлением волос в анаген-фазе (рис. 1А, 2А), а также средние индивидуальные характеристики волос (рис. 1Б, 2Б–Г). Трихоскопический анализ был возможен в начальном периоде появления волосяных стержней, главным образом на 6-е и 7-е сут; далее он становился затруднительным из-за высокой плотности волосяного покрова.

По данным пигментации кожи на 6-е и 7-е сут рост волос в группе Hair FOOD был в 2,3 и 2,5 раза выше, чем в контрольных группах (рис. 2А). Сходным образом в группе Hair FOOD наблюдалось повышение числа волос в поле зрения (в 4,2 и 3,1 раза, рис. 2Б), их толщины (в 2,1 и 1,8 раза, рис. 2В). Результаты показывают, что сыворотка Hair FOOD стимулирует рост волос у депилированных мышей при 7-дневной накожной аппликации. В тех же условиях 2% миноксидил не проявляет достоверного стимулирующего эффекта по сравнению с негативным контролем (см. раздел «Обсуждение результатов»).

Влияние препаратов на микроциркуляцию и оксигенацию кожи

Для оценки кровообращения в обработанной коже применена неинвазивная ЛДФ, позволяющая выявлять местные эффекты веществ и материалов в контакте с кожей [19]. Анализ проводили с использованием зондового анализатора (рис. 3А, Б) и бесконтактного имейджера (рис. 3В, Г). По данным обоих инструментов исследуемые группы характеризовались близкими исходными значениями микроциркуляции кожи (0-й день). Сравнительный анализ был возможен только на этапах, предшествующих росту волос (~3-и сут), так как меланизация кожи экранирует оптический сигнал ЛДФ [20].

Результаты показывают, что микроциркуляция кожи, обработанной Hair FOOD, достоверно превышает почти в 1,4 раза (рис. 3А) и 1,5 раза (рис. 3В) аналогичный показатель в группах сравнения. При этом степень оксигенации обработанной кожи различалась незначительно, что согласуется с пониженной чувствительностью этого параметра к накожным аппликациям [19]. Усиление микроциркуляции кожи при действии сыворотки Hair FOOD может быть следствием ее быстрого сосудорасширяющего и, предположительно, ангиогенного эффектов, характерных для препаратов ФР [10, 14].

Результаты гистологического анализа

Гистологический анализ является незаменимым для изучения действия активных веществ на кожу и волосяные фолликулы [21, 22]На рис. 4 приведены гистологические данные для срезов обработанной кожи, окрашенных HE, на 7-е сут (рис. 4А). Критериями оценки служили: среднее число фолликулов в срезе, индукция фазы анагена (т.е. соотношение фолликулов в подкожной клетчатке и в дерме), а также средняя толщина кожи. Установлено, что сыворотка Hair FOOD повышала содержание фолликулов в 1,7 раза (рис. 4Б) и толщину кожи в 1,4 раза (рис. 4Г) по сравнению с группами контроля и миноксидила (для них значения были сходными). Кроме того, на фоне препаратов сравнения сыворотка Hair FOOD усиливала индукцию анагена почти в 1,7 раза (рис. 4В). Также в случае сыворотки Hair FOOD отмечалось повышение содержания сосудисто-подобных структур и интенсивности меланизация фолликулов в дерме.

Таким образом, гистологический анализ выявил, что сыворотка Hair FOOD в условиях ежедневной накожной аппликации стимулирует образование волосяных фолликулов, значительно повышая содержание фолликулов в фазе анагена. Также результаты указывают на то, что препарат модулирует активность клеток фолликула и кожи, что проявляется в физиологическом утолщении последней.

Обсуждение

Пептидные факторы роста относятся к наиболее активным гормоноподобным веществам, секретируемым различными клетками организма и регулирующим процессы развития, обновления и посттравматической регенерации, в том числе посредством индукции ангиогенеза. В отличие от гормонов, они не разносятся по всему организму, а действуют локально — в пределах ткани/органа, где они выделяются.

Одним наиболее популярных стимуляторов роста волос является синтетический препарат миноксидил (6-(1-пиперидинил)-2,4-пиримидиндиамин-3-оксид)), оказывающий сосудорасширяющее действие и рекомендованный главным образом для лечения и профилактики андрогенной алопеции [23]. Недостаточное понимание механизмов действия миноксидила, наличие у него ряда нежелательных побочных эффектов, а также значительное привыкание к нему обусловливают актуальность поиска более безопасных и при этом эффективных соединений, предотвращающих выпадение волос у разных групп пациентов. Нарушение кровоснабжения волосяного сосочка — один из ключевых факторов дегенерации волосяного фолликула [4], поэтому особое внимание уделяется созданию трихологических средств, усиливающих ангиогенез и трофику тканей.

Пептидные ФР относятся к наиболее активным гормоноподобным веществам, секретируемым различными клетками организма и регулирующим процессы развития, обновления и посттравматической регенерации, в том числе посредством индукции ангиогенеза [24]. Целью нашей работы стало выявление эффектов сыворотки Hair FOOD, содержащей биодоступные пептидные аналоги ФР, на модели регенерации волосяных фолликулов в условиях накожной аппликации in vivo, на ранних этапах и в сравнении с миноксидилом.

Исследование проводили на черных мышах линии C57BL/6, характеризующихся синхронным переходом волос в фазу телогена с ~7-й по 12-ю неделю жизни [25]. Дополнительным преимуществом этой линии является наличие фолликулярных меланоцитов, продуцирующих пигмент на стадии анагена [18]. Мыши были подвергнуты химической депиляции кремом, которая оказалась более щадящей по сравнению с депиляцией воском (данные не приведены). Примененная in vivo модель может рассматриваться в качестве модели регенерации волосяных фолликулов после повреждения (депиляции); она удобна и информативна для изучения регенеративных препаратов [1]. Для оценки эффективности восстановления удаленного волосяного покрова применены 3 группы независимых методов, основанных на комплексном анализе фотографий кожи и волос с помощью ПО Image J (рис. 1, 2), ЛДФ (рис. 3) и гистологическом анализе (рис. 4).

При аппликации сыворотка Hair FOOD лучше впитывалась в кожу по сравнению с миноксидилом, что объясняется различным составом растворителя сравниваемых препаратов. Сообщается, что растворитель миноксидила, содержащий этанол и пропиленгликоль, может быть причиной себореи и контактного дерматита [23]. В условиях эксперимента сыворотка Hair FOOD и миноксидил не проявили местного раздражающего действия на кожу мышей. После депиляции видимое прорастание волос, начавшееся преимущественно на 6-е сут, происходило значительно интенсивней в группе Hair FOOD, чем в контрольной группе (растворитель вода–этанол). Визуальный анализ хорошо согласуется с количественными параметрами начального роста: относительной интенсивностью черного окраса кожи, обусловленного появлением пигментированного меланина в фолликулах (рис. 2А), а также средним числом волос в поле зрения (рис. 2Б). Кроме того, на фоне интенсификации роста волос наблюдалось увеличение средней толщины отдельных волосяных стержней (рис. 2В).

Результаты трихоскопического анализа коррелировали с гистологическими данными, показавшими повышение в группе Hair FOOD общего числа фолликулов, а также содержания фолликулов в фазе анагена на 7-е сут (рис. 4). Фолликулы в этой фазе развиваются преимущественно в подкожной жировой клетчатке, тогда как в дерме преобладают фолликулы в фазе телогена [25]. Примечательно, что эффекты сыворотки Hair FOOD наблюдались на фоне значительного утолщения кожи за счет подкожной жировой клетчатки, которая содержит различные типы клеток, участвующих в регенерации кожи, образовании и росте фолликулов [18]. По-видимому, активация этих клеток компонентами сыворотки улучшает трофику тканей кожи и опосредованно вносит вклад в стимуляцию роста волос.

В группе Hair FOOD меланизированные фолликулы обнаруживались не только в подкожной области, но и в дерме, что дополнительно указывает на активацию фолликулов. Увеличение содержания сосудисто-подобных структур (рис. 4А) также указывает на вероятный ангиогенный эффект компонентов сыворотки Hair FOOD, что согласуется с усилением микроциркуляции кожи по данным ЛДФ (рис. 3). Таким образом, сыворотка Hair FOOD обладает ранним стимулирующим эффектом на рост регенерирующих волос при ежедневной накожной аппликации in vivo. Этот эффект, по-видимому, связан с пептидными и другими активными молекулами сыворотки Hair FOOD, которые обладают высокой биодоступностью при наружном применении и действуют на различные клеточные и тканевые компоненты кожи. Можно предположить, что ранний эффект сыворотки Hair FOOD связан с индукцией фазы анагена через специфические сигнальные пути, такие как Wnt/β-catenin, что характерно для молекул белково-пептидной природы (цитокинов, ФР, антител) [24, 26–28]. Результаты трихоскопического анализа коррелировали с гистологическими данными, на 7-е сут, показавшими увеличение в группе Hair FOOD общего числа фолликулов, что согласуется с неогенезом волосяных фолликулов у мышей [26]. Также в группе Hair FOOD повышалось содержание фолликулов в анаген-фазе (рис. 4).

Результаты проведенного исследования свидетельствуют о том, что сыворотка Hair FOOD индуцирует рост волос на начальном этапе регенерации in vivo за счет различных механизмов. В условиях эксперимента 2% миноксидил не показал достоверной стимулирующей активности, по-видимому, так как этот препарат обладает кумулятивным действием, для проявления которого требуются более продолжительное применение и/или повышение дозы [21, 23].

Благодарность

Работа выполнена в рамках программы повышения конкурентоспособности КФУ среди ведущих мировых научно-образовательных центров на 2013–2020 гг. и при поддержке РФФИ (научный проект № 19-03-01010).

Статья опубликована в журнале «Косметика и медицина» №3-2020

На правах рекламы

Литература

1. Orasan M.S., Roman I.I., Coneac A., et al. Hair loss and regeneration performed on animal models. Clujul Med 2016; 89(3): 327–334.
2. Oh J.W., Kloepper J., Langan E.A., et al. A Guide to Studying Human Hair Follicle Cycling In Vivo. J Invest Dermatol 2016; 136(1): 34–44.
3. Myung P., Ito M. Dissecting the bulge in hair regeneration. J Clin Invest 2012; 122(2): 448–454.
4. Semalty M., Semalty A., Joshi G.P., Rawat M.S. Hair growth and rejuvenation: an overview. J Dermatolog Treat 2011; 22(3): 123–132.
5. Jain R., De-Eknamkul W. Potential targets in the discovery of new hair growth promoters for androgenic alopecia. Expert Opin Ther Targets 2014; 18(7): 787–806.
6. Rishikaysh P., Dev K., Diaz D., et al. Signaling involved in hair follicle morphogenesis and development. Int J Mol Sci 2015; 15(1): 1647–1670.
7. Rinaldi F., Marzani B., Pinto D., Sorbellini E. Randomized controlled trial on a PRP-like cosmetic, biomimetic peptides based, for the treatment of alopecia areata. J Dermatolog Treat 2019; 30(6): 588–593.
8. Madaan A., Verma R., Singh A.T., Jaggi M. Review of Hair Follicle Dermal Papilla cells as in vitro screening model for hair growth. Int J Cosmet Sci 2018; 40(5): 429–450.
9. Reddy B., Jow T., Hantash B.M. Bioactive oligopeptides in dermatology: Part I. Exp Dermatol 2012; 21(58): 563–568.
10. Pyo H.K., Yoo H.G., Won C.H., et al. The effect of tripeptide-copper complex on human hair growth in vitro. Arch Pharm Res 2007; 30(7): 834–839.
11. Lee W.J., Sim H.B., Jang Y.H., et al. Efficacy of a Complex of 5-Aminolevulinic Acid and Glycyl-Histidyl-Lysine Peptide on Hair Growth. Ann Dermatol 2016; 28(4): 438-443.
12. Philp D., Nguyen M., Scheremeta B., et al. Thymosin β4 increases hair growth by activation of hair follicle stem cells. FASEB J 2003; 18(2): 385–387.
13. Ito C., Saitoh Y., Fujita Y., et al. Decapeptide with fibroblast growth factor (FGF)-5 partial sequence inhibits hair growth suppressing activity of FGF-5. J Cell Physiol 2003; 197(2): 272–283.
14. Bassino E., Zanardi A., Gasparri F., Munaron L. Effects of the biomimetic peptide Sh-Polypeptide 9 (CG-VEGF) on cocultures of human hair follicle dermal papilla cells and microvascular endothelial cells. Exp Dermatol 2016; 25(3): 237–239.
15. Nam G.H., Jo K.-J., Park Y.-S., et al. The peptide AC 2 isolated from Bacillus-treated Trapa japonica fruit extract rescues DHT (dihydrotestosterone)-treated human dermal papilla cells and mediates mTORC1 signaling for autophagy and apoptosis suppression. Sci Rep 2019; 9(1): 16903.
16. Choi Y.M., Choi S.Y., Kim H., et al. TGFβ family mimetic peptide promotes proliferation of human hair follicle dermal papilla cells and hair growth in C57BL/6 mice. Biomedical Dermatology 2018; 2: 23.
17. Kang J.I., Yoon H.S., Kim S.M., et al. Mackerel-Derived Fermented Fish Oil Promotes Hair Growth by Anagen-Stimulating Pathways. Int J Mol Sci 2018; 19(9): 2770.
18. Sundberg J.P., Booth C.J., Nanney L.B., et al. 24-Skin and Adnexa, Editor(s): Treuting P.M., Dintzis S.M.,
19. Siraeva Z., Đặng T., Yergeshov A., et al. Evaluation of skin irritation in rats using simultaneous laser Doppler flowmetry and oxygenation monitoring. BioNanoScience 2016; 6(4): 384–387.
20. Abdulhameed Y.A., Lancaster G., McClintock P. V.E., Stefanovska A. On the suitability of laser-Doppler flowmetry for capturing microvascular blood flow dynamics from darkly pigmented skin. Physiol Meas 2019; 40(7): 074005.
21. Son M.J., Jeong J.K., Kwon Y., et al. A novel and safe small molecule enhances hair follicle regeneration by facilitating metabolic reprogramming. Exp Mol Med 2018; 50(12): 1–15.
22. Luong D., Yergeshov A.A., Zoughaib M., et al. Transition metal-doped cryogels as bioactive materials for wound healing applications. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl 2019; 103: 109759.
23. Suchonwanit P., Thammarucha S., Leerunyakul K. Minoxidil and its use in hair disorders: a review. Drug Des Devel Ther 2019; 13; 2777–2786.
24. Yoon S.-Y., Dieterich L.C., Karaman S., et al. An important role of cutaneous lymphatic vessels in coordinating and promoting anagen hair follicle growth. PLoS One 2019; 14(7): e0220341.
25. Muller-Rover S., Handjiski B., van der Veen C., et al. A comprehensive guide for the accurate classification of murine hair follicles in distinct hair cycle stages. J Invest Dermatol 2001; 117(1): 3–15.
26. Wu P., Zhang Y., Xing Y., et al. The balance of Bmp6 and Wnt10b regulates the telogen-anagen transition of hair follicles. Cell Commun Signal 2019; 17(1): 16.
27. Guan W., Yu X., Li J., et al. Anti-CXCL4 monoclonal antibody accelerates telogen to anagen transition and attenuates apoptosis of the hair follicle in mice. Exp Ther Med 2017; 14(2): 1001–1008.
28. McElwee K.J., Huth A., Kissling S., Hoffmann R. Macrophage-stimulating protein promotes hair growth ex vivo and induces anagen from telogen stage hair follicles in vivo. J Investig Dermatol 2004; 123(1): 34–40.